RV вакцины III поколения. Кишечные заболевания.

Новейшие тенденции в разработке RV вакцин связаны с дальнейшими успехами в развитии генноинженерных и молекулярно-биологических технологий.

Наиболее простая методика получения вирусоподобных частиц (ВПЧ) была основана на выявлении в клеточной культуре МА 104, зараженной RV КРС (V1005), «пустых* RV капсидов. Было показано, что они содержали полипептиды, мигрирующие в положении между VP2 и VP6, а результаты пептидного картирования подтвердили связь этих полипептидов с VP2. Авторы доказали также возможность выделения VP2 in vitro при обработке трипсином «пустых» капсидов. Заражение культуры клеток МА 104 другими штаммами RV (UK, NCDV, SA-11 и KU) подтвердило ранее полученные результаты. Однако выделение «пустых» капсидов, содержащих VP7, и их применение для иммунизации крупного рогатого скота выявило неспособность последних к индукции ВНА (Brussow Н. et al., 1990). Таким образом, простая селекция частиц RV по их физико-химическим свойствам не дала положительного результата.

RV вакцины III поколения. Кишечные заболевания-2

Нами также была предпринята попытка выделить «пустые» вирионы из копробиомассы RV. Методом скоростного центрифугирования в прерывистом градиенте плотности хлористого или сернокислого цезия (1,0—1,5 г/см2) нам удалось разделить RV частицы на «полные» и «пустые», что подтвердил электронномикроскопический контроль.

Таким образом, была установлена гарантированная возможность разделения биомассы RV по их плавучей плотности, что может быть использовано как способ или этап очистки, концентрации и накопления вирусного материала при конструировании диагностических и профилактических препаратов (Василье-в Б. Я. и др., 1991).

Развитие генно-инженерного подхода в создании RV вакцин нашло свое отражение в попытках моделирования так называемых субъединичных вакцин.

Использование ВПЧ как кандидат-вакцин, индуцирующих защитный эффект у прививаемых, прошло определенный эволюционный путь. Способ получения вакцинного препарата на основе VP6 послужил предметом заявки на изобретение (Sahara М. et al., патент США, 1990).

Авторы сконструировали препараты, которые содержали эпи-топные молекулы, сцепленные с белковым носителем из мономеров или олигомеров полипептидов гомологичных VP6, которые формировали ВПЧ. Ген VP6 выделяли с помощью рекомбинантных плазмид и затем комплексировали с различными полипептидами RV.

Ранее было показано, что белок внутреннего капсида VP6 обладает способностью к самосборке. На основе этого феномена в настоящее время реализована возможность получения вирусоподобных частиц (ВПЧ) для иммунизации животных. RV гены, кодирующие структурные белки, клонируют в бакуловирус и рекомбинантные RV белки коэкспрессируют в бакуловирусную систему (Estes М. К. et al., 1996; Crawford S. E. et al., 1994; Labbe M. et al., 1991). Экспрессированные RV белки самособира-ются и образуют ВПЧ. Коэкспрессия различных комбинаций структурных белков приводит к формированию ВПЧ с различным белковым составом.

Данные последних лет показали, что парентеральное введение инактивированного RV лабораторным животным приводит к их полной защите от гомологичного перорального заражения, что дало возможность оценить шансы альтернативного пути вакцинации с помощью ВПЧ.

С помощью клонирования и экспрессии в бакуловирусной системе структурных белков VP4, VP6 и VP7 RV КРС (штамм С 486) Redmond М. et al. (1993) были получены ВПЧ, содержащие на основе VP6 либо VP4, либо VP7. В опытах на мышах сконструированные ВПЧ вызывали образование гуморальных антител, выявляемых методом ИЭМ. Однако только ВПЧ с VP4 вызывали образование антител, нейтрализующих вирус и тормозящих гемагглютинацию. Заражение мышей, иммунизированных ВПЧ с наличием VP4, выявило защитный эффект против гомологичного (С 486) и гетерологичного (SA-11) RV. В отличие от этого потомство мышей, получавшее ВПЧ с наличием только VP6, оказалось защищенным частично.

В дальнейшем иммуногенная активность и защитная эффективность парентерального введения ВПЧ различного состава (VP6/7, VP2/6/7, VP2/4/6/7) и адъювантов А1 ОН, QS21 была изучена Conner М. Е. et al. (1996).

Авторы конструировали ВПЧ различного состава в процессе коинфицирования клеток SF9 (0,2 или 5 БОЕ на клетку) различными комбинациями рекомбинантов бакуловируса (Crawford S. Е. et al., 1994). Бакуловирусные рекомбинанты использовали в моделировании ВПЧ, кодируемых VP2 (RF) или VP6 (С 486) КРС; VP6, Р [2] VP4 или G3VP7 обезьяны или Gl VP7 (8697) HRV. ВПЧ были очищены в градиенте плотности хлористого цезия или 40% сахарозы.

В процессе проведения испытаний ВПЧ различного состава рекомбинантов структурных белков двукратно вводили мышам (0,2-20 мкг) и кроликам (10—20 мг) с последующим инфицированием RV SA-11 и ALA. Оказалось, что кролики, вакцинированные VP2/4/6/7 или VP2/6/7, индуцировали высокий уровень RV сывороточных и копроантител класса IgG, но не IgA, а индукция фекальных IgG ассоциировалась с полной или частичной защитой от орального заражения RV ALA. Причем не было обнаружено влияния какого-либо адъюванта на интенсивность иммунологического ответа. У мышей были получены аналогичные результаты с той разницей, что с применением адъюванта QS21 ВПЧ индуцировали ответ антител (по данным ИФА и PH), сравнимый с таковым при иммунизации RV SA-11. Интенсивность иммунологических сдвигов зависила от дозы ВПЧ. Следует отметить, что у мышей, иммунизированных VP2/6/7 или VP2/4/6/7, были обнаружены также и гетеротипические сывороточные и копроантитела. Этот факт особенно важен тем, что показывает возможность снижения числа G-типов, вводимых в субъединичную вакцину, а это, в свою очередь, предполагает возможность конструирования ВПЧ с ограниченным числом белков и тем самым снижения их стоимости. Что касается ВПЧ VP6/7, то они тоже были иммуногенны у мышей, но их относительная нестабильность не способствовала рассмотрению их как потенциальных кандидатов в вакцину. В результате проведенных испытаний авторы сделали вывод, что ВПЧ могут обеспечить безопасную и эффективную альтернативу или дополнение к живой RV вакцине и для людей, и для животных (Conner М. Т. et al., 1996, 1997).

Оценке эффективности различных путей введения ВПЧ, а также их состава и нового иммуноадъюванта посвящена работа O’Neal С. et al. (1997). Авторы изучили иммуногенность и защитную эффективность перорального и интраназального введении RV субъединичной вакцины, содержащей VP2/6 и G3 2/6/7 в смеси с холерным токсином. Оказалось, что пероральное введение взрослым мышам указанных ВПЧ индуцировало появление сывороточных и копроантител классов IgG и IgA. Причем высокие дозы (100 мкг) ВПЧ способствовали защите от последующего RV заражения (> 50% снижение вирусовыделения) у 50% мышей.

Интраназальный метод введения ВПЧ стимулировал более интенсивную, чем пероральный, выработку сывороточных и местных антител. Мыши, получившие ВПЧ интраназально, были защищены от последующего заражения, выделение вируса после заражения отсутствовало. Отсутствовали и различия в иммуногенности и защитном эффекте между 2/6 и 2/6/7 ВПЧ. Следует подчеркнуть, что защита была достигнута без протективных антигенов VP7 и VP4.

Интересные результаты получены при изучении влияния иммуноадъюванта — холерного токсина на иммуногенность и защитную эффективность ВПЧ. Интраназальное введение VP2/6 без холерного токсина вызывало образование сывороточных и кишечных антител в более низких титрах по сравнению с иммунологическими сдвигами при его применении.

Использование высоких доз (100 мкг) VP2/6 без адъюванта стимулировало только частичное снижение вирусовыделения в среднем у 38% инфицированных мышей.

В то же время в аналогичных условиях иммунизации и последующего инфицирования мышей высокий уровень защиты при введении адъюванта был достигнут с дозой иммуногена в десять раз меньшей (10 мкг), чем применялась ранее. Таким образом, интраназальное введение ВПЧ с иммуноадъювантом, по мнению авторов, может служить прообразом безопасной не-реплицирующейся RV вакцины не только для животных, но и для людей.

Наряду с холерным токсином (СТ) авторами в экспериментальных условиях были также испытаны и температуро-чувствительные токсины Е. Coli: LT и LT R129G.

Оказалось, что ВПЧ 2/6 с применением всех этих иммуноадъювантов индуцировали выраженную защиту мышей от последующего RV заражения. Однако мыши, получившие ВПЧ 2/6 в сочетании с адъювантом LT, продуцировали значительно более высокие титры кишечных IgA антител по сравнению с СТ. Все мыши, получившие ВПЧ 2/6 с LT и LT R192G, были полностью (100%) защищены от RV заражения, тогда как с СТ — 91%. Иммуноадъюванты LT и LT 192G оказались безвредными и эффективными иммуностимуляторами, что дало авторам основание рекомендовать их для использования совместно с ВПЧ (O’Neal С. et al., 1998).

В качестве нового направления профилактики RV инфекции в последнее время были предложены ДНК вакцины, кодирующие структурные белки RV (VP4, VP6, VP7) и обладающие определенным защитным потенциалом. При разработке вакцин последнего поколения кроме иммуноадъювантов в их состав вводят также комбинации убитых бактерий или их антигенов, таких как малопатогенные сальмонеллы, а также цитомегалови-рус, полиовирус, аденовирус, вирус оспы.

Следует отметить, что перспектива разработки и использования клонированных энтеробактерий (в частности, кишечной палочки), содержащих в геноме ДНК-фрагменты RV человека, кодирующие синтез вирусспецифических антигенов, обсуждалась еще в конце 80-х годов (WHO Drug Inf., 1989). В качестве векторной системы RV использовали вирус осповакцины (Poncet D. et al., 1990). В результате генно-инженерной разработки был сконструирован рекомбинантный вирус осповакцины с вставкой в тимидинкиназный ген кДНК VP6 SA-11. Заражение этим рекомбинантом клеток МА 104 приводило к экспрессии VP6, который при иммунизации мышей индуцировал образование антител, не обладавших, однако, вируснейтрализующей активностью.

Иммунный ответ на экспрессируемые рекомбинантным вирусом осповакцины чужеродные антигены можно существенно усилить путем «заякоривания» последних на оболочке инфицируемых клеток. При этом усиление иммуногенности VP6 и VP7 может происходить как непосредственно через В-клетки, так и путем активации Т-хелперов (Andrew М. et al., 1991).

В связи с тем, что, как показали более ранние наблюдения, парентеральное введение RV вакцин обеспечивает у мышей и кроликов защиту от заражения (Conner М. Т. et al., 1993; McNeal М. М. et al., 1995), Herrmann I. E. et al. (1996 а) провели исследование по обоснованию возможности использования ДНК вакцин с целью профилактики RV инфекции. Ротавирусные ДНК вакцины были приготовлены путем включения комплементарной ДНК, кодирующей мышиные VP4, VP6 или VP7, в экспрессирующий вектор (Yasutomi Y. et al., 1996). ДНК RV вакцину вводили внутрикожно при помощи так называемой генной пушки (gene-gun).

Метод «gene-gun» заключается в том, что ДНК вакцина адсорбируется на золотых шариках (0,95 ммк), которые вводятся в эпидермис посредством импульса гелия (Accell gene-gun; Agracetus, Middleton, WI). Этот метод является наиболее эффективным способом доставки необходимого количества ДНК вакцины в эпидермис (Fynan Е. F. et al., 1993).

Плазмидные ДНК вакцины (VP4, VP6 и VP7) были оценены в опытах на взрослых мышах (BALB/c) по их способности индуцировать иммунный ответ и защиту против заражения RV EDIM. Оказалось, что двукратное введение мышам 0,4 мкг ДНК вакцин сопровождалось повышением титров IgG антител (по данным ИФА) в среднем до 1:300 при использовании VP4 и VP7 и до 1:3200 — при иммунизации VP6.

В то же время ВНА определялись у мышей, получавших живой вирус (EDIM), ДНК вакцины VP4 или VP7, но не у животных, иммунизированных VP6 ДНК вакциной. Наряду с увеличением титра гуморальных антител возрастало и содержание антител класса IgA, причем наивысшие показатели наблюдали у мышей, вакцинированных VP6 ДНК. Для определения клеточного иммунитета измеряли CTL активность. При соотношении эффектор-мишень 60:1 процент специфического лизиса у мышей, инфицированных RV EDIM, равнялся 57 ± 27%, а при вакцинации VP4 — 32 ± 14%; VP6 — 33 + 31%; VP7 — 42 ± 17%; плазмидный контроль ДНК — 2 ± 2%.

Таким образом, двукратное введение плазмидных ДНК вакцин VP4, VP6 и VP7 продемонстрировало защиту, подобную той, которую наблюдали у мышей, получавших перорально живой RV EDIM в дозе 100 ИД50- Herrmann J. et al. показали, что в механизм защиты вовлечен клеточный иммунитет, IgA опосредованная внутриклеточная нейтрализация неполноценного вируса или оба эти фактора. Авторы полагают, что достигнутые результаты демонстрируют эффективность плазмидных VP4, VP6 и VP7 ДНК вакцин в стимуляции как специфических антител, так и ЦТЛ (Herrmann J. et al., 1996; Chen S. C. et al., 1997). В то же время Choi A. et al. (1997) сообщили, что ДНК VP6, индуцируя высокий уровень преимущественно сывороточных IgG, не способна обеспечить защиту против последующих заражений.

В работах последних лет, посвященных вакцинопрофилакти-ке RV инфекции, появились термины «мукозальная вакцина» и «мукозальный иммунитет». Мукозальные вакцины вводятся через слизистые оболочки (перорально, интраназально, энтераль-но и др.) и содержат специальные адъюванты и антигены, заключенные в микрокапсулы, что обеспечивает их защиту от воздействия пищеварительных ферментов и устойчивость к низким значениям pH.

Метод микрокапсулирования RV базируется на способности ионносвязанных водорастворимых анионных полимеров и аминогрупп усиливать выработку вирусспецифического иммунитета, что было продемонстрировано Knoury С. A. et al. (1995), Brown К. A. et al. (1995). У мышей, иммунизированных перорально инактивированным инкапсулированным и неинкапсули-рованным обезьяньим RV в дозах 1,75 или 0,35 мкг, определяли наличие специфических антител в сыворотке, содержимом кишечника и в органных культурах кишечно-ассоциированных лимфоидных клеток (GALT). Оказалось, что вирусспецифические IgA продуцировались лимфоцитами lamina propria тонкого кишечника животных, иммунизированных обеими дозами мик-роинкапсулированного обезьяньего RV. Мыши, вакцинированные неинкапсулированным RV, оказались иммунотолерантны. Тем самым авторы продемонстрировали, что микрокапсулирова-ние может быть эффективным средством индукции вирусспецифического ответа GALT после орального введения малого количества вирусного антигена. Более того, авторами была показана возможность микрокапсулированной вакцины с определенным сроком биодеградации оказывать бустер-эффект. Следует подчеркнуть, что новый способ доставки вакцины защищает антиген от воздействия ферментов кишечника и различных интерферирующих субстанций, поставляя его непосредственно в пейеровы бляшки (Estes М., 1996).

Таким образом, подводя итоги этапов развития вакцинопро-филактики, необходимо отметить, что наибольшие успехи в защите от RV инфекции связаны с разработкой и многоплановыми испытаниями живых поливалентных реассортантных вакцин, сконструированных на основе совокупности чисто Дженне-ровского подхода и генно-инженерных технологий. В ходе широких клинико-эпидемиологических наблюдений, проведенных в различных регионах мира на контингентах взрослых и детей разного возраста, были показаны их безвредность, невысокая реактогенность, высокая иммуногенная активность и эффективность в предотвращении RV инфекций, а также в снижении частоты тяжелых клинических форм заболеваний и госпитализаций.

Наиболее перспективными из поливалентных реассортантных вакцин являются RRV-TV и WC3, которые в настоящее время проходят заключительные испытания перед лицензированием.

Наряду с вышеуказанными вакцинами II поколения в последние годы сконструированы нереплицирующиеся субъединичные и векторные ДНК вакцины, находящиеся на стадии доклинической апробации.

Положительные результаты, полученные в условиях эксперимента на животных, дают основание полагать, что их изучение может быть продолжено на людях.


Оставьте свой комментарий: