Вирусологические исследования. Кишечные заболевания. (Часть 2)

В процессе применения ПЭМ были изучены методические приемы, позволяющие повысить надежность этого метода. Так, сравнивали эффективность выявления морфологии вирусов в ацетате уранила и фосфорновольфрамовой кислоте при pH 4,5, которые показали примерно равные возможности, причем более высокие, чем у молибдата аммония. Повышение pH этих сред приводило к уменьшению количества всех типов распознаваемых под ЭМ частиц.

Вирусологические исследования. Кишечные заболевания. (Часть 2)

Применение ПЭМ выявило высокую специфичность метода, однако его чувствительность уступала ряду других лабораторных тестов. Исследование 207 материалов от больных с двумя диагностическими наборами ИФА и ПЭМ в качестве референс-метода показало, что чувствительность ПЭМ составила 80% при 100% специфичности, тогда как чувствительность ИФА на основе моноклональных антител была более высокой (Dennehy Р., 1990). Аналогичные данные были получены ранее Васильевым Б. Я. и др. (1989). Сопоставимые соотношения показателей чувствительности и специфичности ПЭМ и реакции агглютинации латекса (62,5% и 75% соответственно) были показаны также Santos N. и Nozawa С. (1989).

Исследования последних лет подтвердили эти данные. Обследование 103 детей методами ПЭМ, ЭФ в ПААГ и реакцией латекс-агглютинации (РЛА) показало, что ротавирус был документирован у 18% детей. Причем чувствительность методов ПЭМ, ЭФ в ПААГ и РЛА составила соответственно 84%, 90% и 80%, специфичность же 100%, 100% и 81% соответственно (Hendricks М. К. et al., 1995). Помимо диагностических целей, ПЭМ применяется и в научно-исследовательских разработках. Так, Zeng С. et al. (1994) использовали ПЭМ при изучении рота-вирусного белка VP2.

Результаты прямой электронной микроскопии расширили представление о функциях и сборке структурного белка VP2, а также формировании вирусоподобных частиц (ВПЧ) и транспорте метаболитов внутри вириона.

Особенно большие успехи были достигнуты в изучении морфологии ротавирусов при помощи модификации ПЭМ — криоэ-лектронной микроскопии, которая позволяет изучать нативный, неокрашенный вирион с разрешающей способностью 35А, что позволяет выявить поверхностные структуры вируса и каналы, пронизывающие вирион (Yeager М. et al., 1990; 1994, Estes М., 1996; Prasad В. et al., 1996).

Таким образом, прямая электронная микроскопия остается эффективным диагностическим методом и оптимальным рефе-ренс-тестом при освоении новых диагностических методик ввиду неоспоримости получаемых при этом результатов, вследствие чего ряд исследователей считают электронную микроскопию «золотым стандартом» (Bryden А. S., 1990). Уникальность ПЭМ состоит и в ее способности обнаруживать помимо всех групп ротавирусов и другие кишечные патогены: адено-, калици-, астро- и короновирусы, а также неизвестные до настоящего времени инфекционные агенты (Espinoza F. et al., 1997).

Иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ) дает возможность не только идентифицировать вирус в материалах от больного по его морфологическим признакам, но и подтвердить этиологию заболевания на специфическом уровне. Принцип проведения исследования состоит в следующем: иммунную сыворотку к ротавирусу в разведении 1:5 смешивают с 0,4 мл 1% осветленной центрифугированием фекальной суспензии. Смесь выдерживают 1 час при комнатной температуре, 12 часов при 4°С, затем центрифугируют в течение 90 минут при 15 000 об./мин для осаждения вирусных частиц и иммунных комплексов. Надоса-дочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в нескольких каплях дистиллированной воды, окрашивают (как уже было сказано выше) и наносят на предметные сетки. Микроскопию препаратов осуществляют при увеличении 50 000.

В этом случае частицы ротавируса с характерной морфологией и размерами выявляются в виде специфических иммунных комплексов, интенсивность образования которых оценивают по числу скоплений на сетке и выражают по условной шкале от 0 до 4+.

По чувствительности и специфичности ИЭМ может соперничать не только с ПЭМ, но даже с таким распространенным методом, как ИФА. Так, при типировании 24 штаммов ротавирусов с помощью ИФА и ИЭМ на основе моноклональных антител к VP7 оказалось, что ИЭМ в 2-16 раз чувствительнее, чем ИФА (Gerna G. et al., 1988).

Помимо стандартной техники ИЭМ в работах ряда авторов проведено изучение специфичности и чувствительности нескольких модификаций этого метода: фильтрация комплекса в агар, иммуносорбентной ИЭМ и макромаркирования комплексом белок А коллоидное золото. Показано, что все модификации ИЭМ, как минимум, в 20-30 раз чувствительнее прямой методики. Наибольшей чувствительностью отличается вариант с меткой белком А — коллоидное золото, который оказался в 1000 раз чувствительнее, чем прямой метод ИЭМ (Athanassions R. et al., 1994; Gonzalez S. A. et al., 1995). Очевидно, что дальнейшее усовершенствование ИЭМ откроет новые возможности для этого метода, но его высокая чувствительность может быть реализована при тщательной стандартизации реагентов, обеспечения кон-тролями, а также при высокой квалификации исследователя.

Область применения ИЭМ весьма обширна: научно-исследовательские разработки, клиническая практика, лабораторная диагностика, включая типирование штаммов ротавирусов, расшифровка эпидемических вспышек и др. (Gerna G. et al., 1988; Васильев Б. Я. и др., 1989; Bates Р. R. et al., 1993; Oishi J. et al., 1993; Zeng C. et al., 1994; Tokieda M. et al., 1996).

ИЭМ (как и ПЭМ) применяют также в качестве референс-теста для оценки показателей чувствительности и специфичности коммерческих диагностических наборов (Ruggeri F. et al., 1992). Иллюстрацией ценности использования метода ИЭМ в расшифровке эпидемиологических вспышек могут служить данные Oishi J. (1993). Так, при вспышке гастроэнтеритов у студентов одного из колледжей в Японии методом ПЭМ по морфологическим признакам в фекалиях больных были обнаружены ротавирусы. Причем эти материалы оказались негативны в ИФА относительно ротавирусов группы А. Применение ИЭМ показало, что эти ротавирусы относятся к возбудителям группы С, что в дальнейшем было подтверждено данными ПЦР.

Суммируя результаты применения ПЭМ и ИЭМ, следует отметить, что эти методы имели первостепенное значение на начальных этапах диагностики ротавирусной инфекции. Однако в дальнейшем, с разработкой приемов обнаружения ротавирусно-го антигена, превосходящих ПЭМ и ИЭМ по чувствительности, простоте и скорости проведения, возможности массового обследования больших контингентов при низких материальных затратах, ПЭМ и ИЭМ отводится почетная роль референс-методов.

В то же время ПЭМ и ИЭМ и до настоящего времени используются в научно-исследовательской и клинической практике как методы обнаружения новых, -неизвестных инфекционных агентов.

Иммунофлюоресцентный метод (ИФМ) применяется в диагностических исследованиях для выявления антигена в клеточной культуре, зараженной материалом от больного, в биоптатах и секционном материале, а также в копроматериалах в двух модификациях.

Принцип прямого метода ИФМ сводится к обработке объекта (зараженных клеток или срезов тканей) специфическими антителами, меченными флюоресцирующим красителем, которые, контактируя с антигеном, дают в люминесцентном микроскопе под влиянием коротковолновой части спектра видимое длинноволновое свечение (зеленое или красное в зависимости от вида красителя). При непрямом методе ИФ объект подвергают двухступенчатой обработке сначала иммунной сывороткой к искомому антигену, а затем меченными флюорохромом иммуноглобулинами, выделенными из антивидовой сыворотки.

Методика проведения ИФМ чрезвычайно проста: мазки-отпечатки, зараженные клетки, осветленная суспензия фекалий фиксируются на предметных стеклах ацетоном при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем препарат обрабатывают антиротавирусной флюоресцирующей сывороткой при одновременном контрастировании фона конъюгатом альбумин-родамином. После инкубирования при 37 С в течение 30 минут, избыток конъюгата отмывают фосфатным буфером (pH 7,0), промывают, высушивают и просматривают в люминесцентном микроскопе. Следует отметить, что взятие копроматериалов в первые часы от начала заболевания увеличивает возможность обнаружения ротавирусного антигена. При проведении ИФМ необходимо включение контролей, в качестве которых применяются: обработка специфическим конъюгатом неинфицирован-ных клеток, а также — гетерологичным конъюгатом клеток, инфицированных ротавирусом. Наиболее часто ИФМ используется при исследовании культуры ткани, зараженной материалами от больных людей или животных, что позволяет быстро обнаружить вируссодержащие.клетки, не ожидая ЦПД (Мнико-ва Л. А., 1988; Harsi C.et al., 1991; Tokieda M. et al., 1996). Так при обследовании в ИФМ и ЭФ в ПААГ 268 больных гастроэнтеритами детей до 1 года было выявлено 40 положительных проб (14,9%), в иммунноферментном тесте — 46 (17,1%). Совпадение результатов этих методов наблюдалось в 72% случаях (Harsi С et al., 1991).

В последние годы иммунофлюоресцентная метка антител широко используется для выявления фокусов (пляк) ротавирусов в культуре клеток, что существенно повышает чувствительность этого метода (Isa P.et al., 1994; Barnes G. et al., 1997). Применяется ИФМ и с целью обнаружения ротавирусов во внешней среде (Strappe Р., 1990).

Таким образом, в настоящее время иммунофлюоресцентный метод исследования в классическом варианте находит ограниченное применение в диагностике ротавирусных гастроэнтеритов.

Преципитационные тесты основаны на взаимодействии специфической сыворотки с вирусными антигенами в агаре под влиянием осмотических процессов (РПГ) или при воздействии постоянного электрического поля — встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ) (Галко Н. В. и др., 1986; Залесских А. Ф. и др., 1990). Указанные методы были использованы на начальных этапах изучения ротавирусной инфекции и в настоящее время практически не применяются в связи с разработкой более совершенных тестов, за исключением тонких научных исследований (Devitt С. et al., 1993). Правда, в последние годы преципитационные тесты были усовершенствованы путем введения в реакцию ротавирусных частиц, меченных 32Р, что позволило увеличить как чувствительность, так и специфичность метода (Tosser J. et al., 1994; Johansen К. et al., 1994; Richardson S. et al., 1993; Colomina J. et al., 1998), а также белка А золотистого стафилококка (Colomina J. et al., 1998).

Иммуноферментный анализ (ИФА) в диагностике ротавирусных гастроэнтеритов применяется наиболее широко. Число публикаций на эту тему насчитывает несколько сотен.

Принцип метода твердофазных ИФА сводится к тому, что некий носитель из полимерного материала (лунки микропанелей, бусинки, палочки и т. д.) сенсибилизируют антителами к ротавирусам, добавляют исследуемый материал от больного и инкубируют при 36°С. Образовавшийся комплекс АТ-АГ выявляют либо антителами, меченными ферментам, либо сначала обрабатывают сывороткой к искомому антигену, а затем антиви-довыми иммуноглобулинами, меченными ферментом. Выявление комплекса АТ-АГ-АТ + фермент или АТ-АГ-АТ1-АТ2 + фермент осуществляют добавлением субстрата для появления окрашенного продукта реакции. Учет результатов реакции проводят с помощью иммуноферментных анализаторов. Помимо выявления ротавирусного антигена ИФА позволяет также проводить серотипирование изолятов непосредственно в материалах от больных. Для этой цели был предложен метод блокирования определенных эпитопов генома RV с помощью моноклональных антител типовой или подгрупповой специфичности (Green К. et al., 1990). Применение моноклональных антител VP7 и VP4 различных серотипов ротавирусов человека позволяет провести не только типирование изолятов, но и способствует изучению эпидемических процессов (Bishop R. et al., 1989; Gerna G. et al 1989; UnicombL. et al., 1993; Buesa G. et al., 1996; Gomez J. et al., 1990; Begue R. et al., 1992; Coulson B. S., 1993; Woods P. et al., 1992; Nirdnoy W. et al., 1995; Wu H. et al., 1998; Masen-dyzac P. et al., 1998).

Первые наборы ИФА были созданы как лабораторные тесты в конце 70-х годов, потом были разработаны коммерческие препараты. Первым коммерческим набором является Rotazyme (Abbot Laboratories Ltd), в котором использовали шариковую систему. Затем Dako Ltd создало более совершенный набор — Fast Elisa Dako Ltd, и в настоящее время число коммерческих тестов, используемых в диагностической практике, чрезвычайно велико: IDEIA Rotavirus test, Dakopatts, тест-система WHO, Testpack Rotavirus, Rotavirus EIA, Pathfinder, Kallestadt| Rotaclone, Rotavirus BIO — Bioenzabead Litton, Rotazyme II Abbott, Rotoscreen, Wellcozyme, Enzymgnost Rotavirus, Rotavirus Immunoassay, VIDAS Rotavirus, NIV (Gowez J. et al., 1990; Begue R. et al., 1992; Rosmus K. et al., 1992; Kelkar S., 1993; Unicomb L. et al., 1993; Sanchez R. et al., 1993; Broor S. et al.’ 1993; Dennehy P. et al., 1994).


Оставьте свой комментарий: