Вирусологические исследования. Кишечные заболевания. (Часть 3)

Вирусологические исследования. Кишечные заболевания. (Часть 3)-2

Все первые наборы были основаны на «сэндвич»-принципе, последующие использовали «тандем»-вариант. В процессе конструирования наборов проведены различные усовершенствования, касающиеся как самой постановки ИФА и обработки Проб, так и применяющихся буферных систем. Например, ряд авторов рекомендовали применение ЭДТА для снятия внешней капсидной оболочки, что обнажает групповые антигены внутреннего капсида. Другие предлагали обработку проб ИГЛ МЭМ с 0,5% гидролизатом лактоальбумина и антибиотиками, позволяющую применять этот экстракт для обнаружения вируса на культуре ткани и в ПЭМ, что дает возможность использовать один и тот же образец в различных методах исследования. Очень важное значение имеет буферный раствор для промежуточной промывки. Большинство из этих буферов содержит соляной раствор с низкой концентрацией детергента, ТВИН-20 (Bryden A. S., 1990). Все наборы включают позитивные и негативные контроли. В качестве негативного контроля могут использоваться как буферные растворы, так и специальные негативные сыворотки. В качестве положительных контролей применяют тестированные положительные сыворотки. Следует все же отметить, что интерпретация результатов варьирует от теста к тесту. Главным показателем того или иного набора является минимальная реактивность или «cut-off», которая обычно используется для определения положительного результата и является разницей между уровнем негативного контроля и позитивным уровнем, при этом в идеале оптическая плотность (ОД) негативного контроля должна быть <0,1. Однако на практике этот показатель колеблется у различных тестов. Что касается положительного результата, то он может быть достоверен в подавляющем большинстве случаев при показателях ОД > 0,5, т. е. в несколько раз превышает ОД негативного контроля. В то же время небольшая часть образцов слабо реагирует с ОД между «cut-off» и 0,5. Многие из них могут быть отрицательны в ПЭМ, но большая часть — положительна при ЭФ в ПААГ, ПЦР. Эти моменты необходимо принимать во внимание при проведении и учете ИФА.

В связи с большим количеством коммерческих тест-систем появилась целая серия работ, посвященных определению их сравнительной эффективности.

Следует отметить, что первые коммерческие тест-системы были далеки от совершенства по показателям чувствительности и специфичности. Так, Gibchrist М. et al. (1987) на материалах от 136 больных были определены эти показатели для 4 тест-систем ИФА: Rotavirus EIA, Pathfinder, Rotavirus Bioenzabead и Rotenzyme II, равные 91%, 98%, 80%, 84% и 100%, 78%, 95%, 88/о соответственно. Выявлена невысокая специфичность тест-систем Pathfinder и Rotazyme II, последняя давала ложноположительные результаты и по данным других авторов.

С целью повышения специфичности тест-систем исследователи стали использовать моноклональные антитела. Проведенные испытания поликлональных и моноклональных антител показали преимущество последних. Группа авторов определяла показатели диагностической эффективности двух тест-систем, основанных на моноклональных антителах (Rotaclone, Pathfinder), и трех систем на основе поликлональных антител (Rotavirus EIA, Rotazyme II, Wellcozyme Rotavirus Dennehy P. et al., 1998). При изучении 100 проб кала от больных гастроэнтеритом, проверенных в ЭФ в ПААГ, было показано, что обе тест-системы на основе моноклональных антител отличались максимальной (100%) чувствительностью. Чувствительность же поликлональных тест-систем превышала 90% при колебаниях специфичности в пределах от 55 до 100% (Dennehy Р. et al., 1988).

Flewett Т. et al. (1989) на материалах от 1163 детей (в т. ч. 66 новорожденных) сравнивали диагностическую эффективность тест-системы фирмы Dakopatts и стандартной тест-системы ВОЗ. Чувствительность и специфичность Dakopatts были равны 97% по сравнению с тест-системой ВОЗ. Причем при исследовании материалов от новорожденных эти показатели испытуемой тест-системы составили 100% и 98% соответственно.

Сравнительная оценка других тест-систем ИФА: Rotascreen, Wellcozyme, Rotazyme II и IDEIA показала, что только Rotascreen и IDEIA имели специфичность и чувствительность более 90% (Molyneaux Р. J. et al., 1989).

В связи с данными об отставании специфичности ИФА от ее чувствительности были предприняты попытки усовершенствования метода, которые позволили улучшить эти параметры. Сравнительное изучение чувствительности, специфичности, а также совпадения положительных и отрицательных результатов коммерческих наборов VIDAS Rotavirus, Rotaclone и Pathfinder под контролем ПЭМ при исследовании 464 копроматериалов показали блестящие результаты: VIDAS Rotavirus 98; 99,3, 98,7 и 99%; Rotaclone — 100; 99; 98 и 100; Pathfinder — 100; 92,4; 87,3 и 100% (Dennehy Р. Н. et al., 1994). Как видно из приведенных данных, качественные параметры коммерческих тест-систем стали настолько высоки, что ряд исследователей (как нам кажется, несколько преждевременно) предложили использовать в качестве референс-стандарта набор для ИФА Rotaclone, Cambridge Biosci. Corp. (Dennehy P. H. et al., 1990). Однако no мнению более осторожных авторов, для получения абсолютно точных данных необходимо наряду с ИФА применять и другие методы исследования: ПЭМ, ПЦР, ЭФ в ПААГ (Donneli G. et al., 1993; Husain М. et al., 1995; Markowsca-Daniel J. et al., 1996; Buesa G. et al., 1996; Dennehy P. H. et al., 1994; Jiang B. et al., 1995). Несмотря на достигнутые успехи в разработке тест-систем для ИФА, исследования по их усовершенствованию продолжаются. Так, Ribas-Antunez М. et al. (1998) провели сравнительную оценку точечной ИФА и ЭФ в ПААГ при обследовании 100 образцов копроматериалов. Авторами была продемонстрирована высокая чувствительность, специфичность и совпадение результатов этих методов.

Наряду с применением коммерческих тест-систем успешные попытки разработки лабораторных наборов для ИФА были предприняты рядом авторов (Ruggeri F. et al., 1992; Husain M. et al., 1995; Buesa J. et al., 1996). Авторские лабораторные тесты по основным показателям не уступали коммерческим тест-системам. Так, в Индийском национальном институте вирусологии (Pune) был разработан набор для диагностики ротавирусной инфекции (NIV), который был сопоставлен с коммерческим набором Dakopatts (Kelkar S. D., 1993). В процессе параллельного обследования 63 проб оказалось, что NIV выявил 36 инфицированных лиц (57%), Dakopatts — 33 (52%) при 100% специфичности. Однако стоимость лабораторного препарата была значительно ниже других коммерческих наборов, что позволило авторам предложить использование NIV в развивающихся странах.

В нашей стране также налажен выпуск отечественных коммерческих тест-систем для ИФА: «Ротапаст» (С.-Петербург), «Rota антиген» (Н. Новгород), «Рота-анализ» (Екатеринбург). Чувствительность и специфичность этих наборов, к сожалению, уступает аналогичным показателям зарубежных препаратов и составляет 75%, при совпадении положительных результатов — 90%, отрицательных результатов — 86% (Карпович А. Г. и др., 1991). В то же время в ряде лабораторий разработаны и апробированы собственные тест-системы ИФА для диагностики ротавирусов: Букринская А. Г., 1988; Васильев Б. Я. и др., 1989; Рамишви-ли Л. Г. и др., 1991; Дзюблик И. В. и др., 1990; Носатенко А. И. и др., 1991).

Таким образом, высокие показатели чувствительности и специфичности, скорость проведения исследований и возможность учета результатов в автоматическом режиме обеспечивают приоритетность ИФА среди других лабораторных методов диагностики ротавирусной инфекции. Следует отметить, что ИФА применяется не только для обнаружения антигена, но и для типирования выявленных вирусов. Такой широкий спектр возможностей метода делает его незаменимым в любой лаборатории.

Осадочные тесты включают все диагностические реакции, основанные на агглютинации частиц (эритроциты, латекс, бактерий), сенсибилизированных антигенами или антителами, которые способны агрегироваться в присутствии гомологичных сывороток или антигенов. При этом частицы выполняют роль носителей специфических детерминант, агрегирование которых происходит в результате реакции антиген-антитело, что регистрируется визуально по наличию и характеру сформированного осадка. Вследствие этого применение осадочных тестов позволяет обнаруживать как антигены, так и антитела.

Реакция гемагглютинации (РГА) основана на способности эритроцитов человека, различного вида животных и птиц агглютинировать ротавирусы человека и животных. Эту реакцию применяли на начальных этапах изучения и диагностики ротавирусной инфекции (Дроздове. Г. и др., 1982). Более поздние исследования показали, что не все штаммы ротавирусов способны агглютинировать эритроциты (Ezeqiel М. et al., 1995). В связи с этим диагностическая ценность этого метода становится сомнительной и в настоящее время РГА практически не используется. В то же время имеются сообщения о применении реакции гемагглютинации в исследованиях поискового характера, касающихся определения способности эритроцитов человека и животных агглютинировать ротавирусы разных групп, а также изучения условий, при которых происходит гемагглютинации (Devitt С. М., 1993). Работы последних лет посвящены определению белков генома, ответственных за гемагглютинацию и аминокислотную последовательность, кодирующую эту способность. В результате удалось установить домен гемагглютинации, расположенной между 93 и 203 АА VP4 (Crawford S. et al., 1994; Ezeqiel M. et al., 1995).

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РИГА или РПГА) достаточно часто применяется в лабораторной практике (особенно в условиях небольших лабораторий) при необходимости обследования больших контингентов заболевших и быстрого получения результатов (Кравченко Т. М. и др., 1991; Зарубинский В. Я., Колпаков С. А., 1989; Закирова С. Ф. и др., 1990; Васильев Б. Я. и др., 1987; 1989; Гирин В. Н. и др., 1991; Абенова У. А. и др., 1991).

В отличие от РГА, в РИГА используют эритроциты, сенсибилизированные ротавирусным антигеном. Традиционным объектом для сенсибилизации являются эритроциты человека, барана и птиц — кур, индеек, уток. Приготовленные из эритроцитов птиц препараты оседают быстрее, что позволяет сократить сроки проведения анализа без потери чувствительности реакции. Процесс прикрепления антител к эритроцитам осуществляется посредством целого ряда реагентов, наиболее распространенными из которых являются амидол и ВДВ (бидиазотированный бензидин). Причем использование иммуноглобулинов в сенсибилизации эритроцитов повышало эффективность диагностического препарата (Чубова Н. В. и др., 1991). В наших исследованиях РИГА проводили с эритроцитарным диагностикумом по методике, разработанной в Свердловском НИИВИ.

Результаты определения ротавирусов в копроматериалах показали, что чувствительность РИГА составила 72% по сравнению с 86% в ИФА, а совпадение результатов под контролем ПЭМ и ИЭМ составила 100% (Васильев Б. Я. и др., 1989). Сравнение результатов РИГА с ПЭМ, ВИЭФ и РСК обнаружило более высокую чувствительность РИГА (Тамендарова Н. Ч. и др., 1989). Сходные данные и на материалах от 866 детей, полученные при применении РИГА, ПЭМ и ИЭМ (Зарубинский В. Я., Колпаков С. А., 1989). Оказалось, что чувствительность РИГА была равнозначна ПЭМ, а совпадение между этими методами составили 96,6%. Сопоставимые результаты были получены позднее Абеновой У. А. и др. (1961). Обследование 1458 копроматериалов детей, госпитализированных с RV инфекцией, с помощью РИГА, РСК, ВИЭФ и ПЭМ выявило RV антиген в 35,8; 26,2; 18,2 и 39,8% образцов соответственно. Следовательно, РИГА продолжает применяться в лабораторной диагностике, но отсутствие стабильных при хранении коммерческих эритроцитарных препаратов затрудняет ее широкое использование с целью выявления ротавирусных антигенов в материалах от больных. Наряду с прямой РПГА в лабораторной практике используется метод обратной РПГА, который применяется для определения RV в культуре клеток и копроматериалах и в настоящее время (Tokieda М. et al., 1996; Kuzuya М. et al., 1998).


Оставьте свой комментарий: