Вирусологические исследования. Кишечные заболевания. (Часть 5)

Примерами использования Western-blot для изучения структуры белков RRV-2, SA-11, DS-1 служит работа Павлова и др. (1991). Применив гипериммунные сыворотки, авторы с помощью иммуноблота провели анализ VP1, VP2, VP4, VP7 — эталонных штаммов ротавирусов обезьяны и человека. Позднее Zeng Q. et al. (1994), применив методику Western-blot с последующим использованием моноклональных антител для иммуно-блотинга, изучили функции VP2, SA-11, механизм сборки частиц VP2, VP2/6 и транспорт метаболитов внутри ядра.

Наиболее распространенным способом молекулярной гибридизации является РНК-РНК гибридизация как в Dot-blot, так и в Northern-blot. Dot-blot (точечная гибридизация) является наиболее простым вариантом молекулярной гибридизации, позволяющим количественное определение вирусных нуклеиновых кислот. Northern-blot — вариант молекулярной гибридизации, при котором разделенные нуклеиновые кислоты извлекают из электрофоретической матрицы, переносят и иммобилизируют на поверхность твердой фазы в той же последовательности, как они находятся в геле. В то же время, использование в Dot-blot’e и Northern-blot’e зондов к отдельным генам ротавируса, в том числе VP7 и VP4, дает возможность типировать изоляты непосредственно в материалах от больного.

Метод молекулярной гибридизации используется в диагностике ротавирусной инфекции (Новикова Н. А. и др., 1991, 1998; Красько А. Г. и др., 1991; Гиневская В. А. и др., 1992; Fer-nandoz J. et al., 1992; Steele et al., 1996; Husain M. et al., 1996), но чаще для решения таких задач, как типирование изолята, изучение атипических штаммов, межвидовой и межгрупповой реассортации, при проведении исследований в области молекулярной эпидемиологии, а также межвидовой и межгрупповой реассортации (Gorrell R. Y. et al., 1996; Kuzuya M. et al., 1996; Nakagomi 0., Nakagomi T., 1991 (а, в); 1996; Ward R., 1990, 1991; Qian Y. et al., 1991; Palombo E. et al., 1998).

Принципиальная возможность применения точечной гибридизации для диагностики RV инфекции человека была продемонстрирована Красько А. Г. и др. (1991). В качестве зондов использовались 32Р-меченные сегменты генома RV свиней, транскрибированные in vitro путем активации эндогенной РНК-зави-симой РНК-полимеразы, причем транскрипты были получены ко всем 11 сегментам RV.

Применение этого метода с использованием в качестве зонда РНК RV SA-11, также меченную 32Р, позволило Новиковой Н. А. и др. (1991) обнаружить РНК RV в носоглоточных смывах 29 (76,3%) из 38 больных РВГЭ, что подтверждает возможность транскрипции генома RV в клетках слизистой оболочки носоглотки.

Диагностическая ценность РНК-РНК гибридизации была продемонстрирована Fernandoz J. et al. (1992) при обследовании 303 проб стула от больных РВГЭ методом Dot-blot. Олигонуклео-тидный зонд состоял из 40 нуклеотидов участка 33-72 гена VP7, наиболее консервативного у многих ротавирусов. В качестве метки использовали биотин (биотин-7 дАТФ). Наряду с Dot-blot применяли ЭФ в ПААГ и ИФА. Всего было выявлено 230 положительных случаев, подтвержденных точечной гибридизацией и ЭФ в ПААГ. Менее надежным оказался ИФА, который выявил 7 ложноположительных и 12 ложноотрицательных образцов. Чувствительность метода составила 200 пг (Fernandoz J. et al., 1992). Разрешающая способность Northern-blot была выше и позволяла обнаружить до 6,0 пг гомологичной РНК, причем зонды не реагировали даже с 100 нг гетерологичной РНК (Ali А. et al., 1993).

Использование специфических зондов к разным G- и Р-типам открыло возможность получить четкую картину циркуляции ротавирусов в различных географических зонах (Sethabuthz О. et al., 1992; Husain М. et al., 1996; Correll R.Y. et al., 1996; Isa P. et al., 1996; Adah M. et al., 1997).

РНК-РНК гибридизация позволила документировать наличие межгрупповой реассортации, происходящей в естественных условиях, а также при культивировании ротавирусов, относящихся к различным геногруппам, на культуре клеток (Ward R., 1990; 1991).

Этот метод способен также более точно охарактеризовать принадлежность того или иного вируса к определенной группе. Известное разделение ротавирусов на I и II подгруппы на современном этапе не совсем соответствует действительности, т. к. не все изоляты укладываются» в уже известные характеристики. Так, например, штамм AU-1 не соответствует характеристике подгруппы I, обладая тем не менее длинным форетипом. Только использование данных РНК-РНК гибридизации позволило выделить этот штамм и сходные с ним изоляты в отдельную группу (Nakagomi О., Nakagomi Т., 1991 (а, в); 1992). Более того, РНК-РНК гибридизация классифицирует ротавирусы на генетическом уровне (т. н. genogrouping), что особенно ценно для изучения атипичных ротавирусных изолятов (Nakagomi О., 1996).

Наряду с РНК-РНК гибридизацией показана возможность использования РНК-ДНК гибридизации (Southern-blot). С этой целью методом обратной транскрипции были получены комплементарные ДНК (к ДНК) к различным сегментам геномной РНК. Было показано, что наиболее эффективная гибридизация наблюдается при использовании в качестве зонда кДНК к сегменту 3 генома RV. В качестве метки использовали 32Р. Эффективность Dot-blot РНК-ДНК гибридизации составила 0,5 нг. При этом специальными исследованиями было показано, что используемые кДНК-зонды не дают перекрестных реакций с РНК RV других групп (Eiden J. et al., 1989).

Следует отметить, что проведение точечной РНК-ДНК гибридизации для дифференциации серотипов в присутствии 50% формамида делает эту реакцию строго специфической (Rosen В. et al., 1990). Причем проведение реакции гибридизации возможно не только с олигонуклеотидами, меченными 32Р, но и щелочной фосфатазой (ЩФ). Причем использование обеих меток при исследовании 148 проб методом РНК-ДНК гибридизации показало сходные результаты (Sethabutr О. et al., 1992).

Southern-blot нашел широкое применение в обнаружении ротавирусного генома и в окружающей среде. С помощью РНК-ДНК гибридизации RV был обнаружен в питьевой воде, в почве, сточных водах (Гиневская В. А. и др., 1992; Zothikumae N. et al., 1995; Grinde В. et al., 1995; Dubois E. et al., 1997).

Таким образом, методы гибридизации характеризуются неизмеримо более высокой чувствительностью и специфичностью, чем лабораторные тесты, и с успехом могут быть использованы в качестве эталона для их оценки. Они являются универсальным методом диагностики и типирования ротавирусов и позволяют проводить типирование изолятов непосредственно в материалах от больных.

В последние годы на основе новейших достижений генной инженерии и биотехнологии разработан уникальный метод диагностики вирусных инфекционных заболеваний с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). В отличие от ставших уже традиционными методов ИФА, блот гибридизации, обеспечивающих надежную детекцию 0,1-10 млн молекул-мишеней (антигенов или нуклеиновых кислот), метод ПЦР позволяет выявить всего лишь одну молекулу нуклеиновой кислоты в пробе.

ПЦР основана на двух основных свойствах нуклеиновой кислоты — возможности разделения синтезирующихся двойных цепей геномной ДНК и повторного синтеза на их основе комплементарных нуклеиновых структур.

Для проведения реакции из исследуемой пробы с помощью протеиназы К и фенол-хлороформа выделяют нуклеиновые кислоты (Oischi J. et al., 1993; Gouvea V. et al., 1991). В связи с необходимостью применения таких токсических веществ, как фенол, хлороформ, фреон, в дальнейшем был разработан метод выделения и очистки двунитчатой РНК, основанный на использовании гуанидинизотиоцианата, гидрооксиапатита и цетилтри-метил аммония бромистого (Santos N., Gouvea V., 1994). Метод прост, эффективен, позволяет освобождать РНК от ингибиторов ферментов и дает больший выход вирусных РНК. Денатурированные методом отжига (90°С) нуклеиновые кислоты помещают в среду с добавлением нуклеотидных праймеров и термоустойчивой ДНК-полимеразы. При 36“С на отдельной цепи ДНК с помощью ДНК-полимеразы синтезируется комплементарная ей структура. Праймеры определяют, какой участок РНК будет репродуцирован, а добавление стоп-кодонов приводит к тому, что полимеризация идет не по всей длине цепи ДНК, а только на одном участке цепи, ответственной за определенные функции генома, т. е. группо-, типо- или сероспецифические последовательности генома. Затем температуру повышают до 58-60°С, в результате чего синтезированная двойная нить распадается. Далее температуру понижают до 36°С, и синтез комплементарных цепей повторяется уже на двух разделившихся цепях и т. д. В результате многократного повторения этой процедуры число строго специфических для каждого возбудителя нуклеотидных последовательностей возрастает на несколько порядков. Теоретически вопрос о чувствительности просто снимается, поскольку в этом случае из одной цепи можно получить 1000-кратное накопление нуклеотидных последовательностей. Этот не требующий радиоизотопов метод оказался в 1 000 000 раз чувствительнее стандартного метода с использованием электрофорети-пов днРНК — сегментов генома и в 5000 раз чувствительнее метода молекулярной гибридизации (Xu L. et al., 1990). По данным Eiden J. et al. (1991) чувствительность ПЦР в рутинных исследованиях приближается к фемтоколичествам (более 80 фг).

Следует отметить, что в качестве исходной молекулы для ПЦР может быть использована ДНК или кДНК, полученная с помощью предварительной обработки РНК обратной траскрип-тазой с последующей амплификацией. РНК извлекают как из свежеполученных клеток, тканей, так и замороженных, лиофи-лизированых или фиксированных препаратов, т. е. объектов, ранее недоступных для анализа. Эта разновидность ПЦР носит название ревертазной обратно транскриптационной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Сущность этой модификации ПЦР заключается в использовании пары олигонуклеотных праймеров, способных специфически гибридизоваться с последовательностями нуклеотидов на противоположных концах двух цепей участка ДНК. В качестве затравки для одновременного синтеза комплементарных цепей используют термостабильную ДНК-полимеразу. Повторные циклы денатурации двойной спирали ДНК и достройки нитей после отжига с праймерами приводят к экспоненциальному росту количества фрагментов ДНК, фланкированных последовательностями нуклеотидов, соответствующих первичной структуре праймеров. В результате 30-40 циклов амплификации количество молекул ДНК в реакционной пробе увеличивается в 108-108 раз, что позволяет определить 104 ЦПДво/мл и не дает перекрестных реакций с другими вирусами (Kweon С. Н. et al., 1997). В то же время ни одна из пар праймеров RV не реагировала в ОТ-ПЦР с образцами фекалий, содержащих ротавирусы другой группы, а также с образцами от контрольных неинфицированных людей и животных, что говорит о высокой специфичности метода (Eiden J. et al., 1991).

Амплификационные последовательности можно увидеть в УФ свете, после фракционирования продуктов ПЦР с помощью гель-электрофореза в присутствии бромистого этидия (Gouvea V. et al., 1991; Oishi I. et al., 1993). Полученное количество фрагментов ДНК является достаточным для анализа с помощью других молекулярно-биологических методов: Dot-blot гибридизации, секвенирования, клонирования и др.

В настоящее время осуществлен подбор праймеров для выявления ротавирусов группы А, В и С по генам 9, 8 и 6 соответственно (Gouvea V. et al., 1991; Oishi I. et al., 1993; Buesa I. et al., 1996). Метод ОТ-ПЦР используют для определения ротавирусов даже в тех случаях, когда другие методы не позволяют идентифицировать их (Ushijima Н. et al., 1992; Oishi I. et al., 1993; Jiang B. et al., 1995). В работах последних лет приводятся данные по применению ПЦР для G- и Р-серотипирования RV. Авторы показали, что наиболее часто обнаруживали у людей ротавирусы, относящиеся к типам G1-G4 и Р4, Р6, Р8 и Р10 (Taniguchi К. et al., 1992; Correll R. J., Palombo E. A., 1996; Husain M. et al., 1996; Espinoza F. et al., 1997). Эти данные позволяют быстро получить детальную информацию о молекулярных основах эпидемиологической вариации ротавирусов, что чрезвычайно важно как в эпидемиологии, так и в конструировании ротавирусных вакцин (Richardson S. et al., 1998; Leite I. et al., 1996; Arista S. et al., 1997; Adah M. et al., 1997).

Несмотря на большое количество исследований, подтверждающих высочайшую специфичность и чувствительность ПЦР, рядом авторов проведены сравнительные испытания этого метода с традиционными способами диагностики: ИФА, ЭФ в ПААГ, ПЭМ. Более высокая чувствительность ПЦР по сравнению с ИФА продемонстрирована Wilde J. При обследовании 40 детей было получено 103 пробы стула. В ПЦР обнаружено 60 положительных случаев (53%) по сравнению с 37 (36%) в ИФА. Кроме того, средняя продолжительность экскреции вируса была равна 9,5 дня по данным ПЦР, по сравнению с 5,6 днями в ИФА (Wilde J. et al., 1991). Сходные результаты, свидетельствующие о более высокой чувствительности ПЦР по сравнению с ИФА, получены Tani-guchi К. При идентификации 115 копроматериалов от больных детей авторы установили, что методом ПЦР диагноз подтвержден в 93% случаев против 82,6 по ИФА. (Taniguchi К. et al., 1992).

Более поздние работы полностью подтвердили эти результаты. Так, при сравнении ПЦР, ПААГ и ИФА, использованных для обнаружения ротавирусов в материалах больных детей, процент положительных находок составил: 94, 91 и 80% соответственно (Husain М. et al., 1995). Аналогичные результаты получены при обследовании 220 больных ОКЗ. Процент обнаружения ротавируса в материалах лиц, обследуемых методами ПЦР, ИФА, ПААГ и ПЭМ, соответственно составил 30, 29, 26,8 и 25,4 (Buesa J. et al., 1996). По данным Masendyacz Р. et al., показатели чувствительности и специфичности трех методов обнаружения RV в копроматериалях диарейных больных составили: ПЦР — 92 и 98%; РНК-ДНК гибридизация — 80 и 99%; ИФА — 73 и 81% (Masendyacz Р. et al., 1998).

Как показывают представленные данные, анализ ротавирусных РНК все шире внедряется в практику, несмотря на определенную сложность и дороговизну исследования, и используется как для диагностики, так и для характеристики патогена. Этот процесс был интенсифицирован с разработкой ПЦР, наиболее чувствительного и специфичного метода диагностики, который, по мнению многих авторов, в настоящее время является «золотым стандартом», каковым ранее являлась ПЭМ (Nakagomi О. et al., 1994; Masendyacz Р. et al., 1998).

Таким образом, ПЦР представляет собой молекулярно-биологический тест нового поколения, открывающий большие возможности в классификации, типировании, общей и молекулярной эпидемиологии ротавирусов. Однако следует отметить, что ПЦР требует высокой квалификации исследователей, дорогих реагентов и сравнительно сложного оборудования. В то же время, дальнейшее усовершенствование методики, очевидно, сделает ПЦР более доступной для широкого круга диагностических лабораторий.

Подводя итоги применения методов идентификации ротавирусов в различных объектах исследования, следует отметить, что практически каждый из рассмотренных в этом материале методов обладает как преимуществами, так и недостатками, выраженными в той или иной степени. Скорость получения ответа, возможность обследования большого количества проб одновременно, сложность метода и необходимость использования дорогостоящей аппаратуры и реагентики, чувствительность метода и его специфичность и, в конечном счете, стоимость одного анализа каждого из этих методов существенно отличаются. Отсюда — выбор адекватного метода в каждом отдельном случае индивидуален и представляется непростой задачей ввиду многочисленности тестов, различных возможностей диагностической лаборатории и задач, стоящих перед ними.