Вирусологические исследования. Кишечные заболевания. (Часть 1)

Выделение вируса. Обнаружение вирусного агента — возбудителя патологического состояния является одним из основных доказательств в триаде Коха причинности возникновения инфекции. В связи с этим выделение вируса чрезвычайно важно и является основополагающим звеном в цепи мероприятий по лабораторной диагностике ротавирусной инфекции. К тому же вирусовыделение остается одним из немногих методов, применение которых может сопровождаться обнаружением новых вирусных агентов-возбудителей неизвестных в настоящее время вирусных заболеваний. Поэтому выделение вируса на различных биологических моделях (в большинстве случаев — культура клеток) практикуется чрезвычайно широко. В настоящее время в качестве биологической модели наиболее часто используется целый ряд клеточных культур: МА104, 4647, GBK, НТ-29, CV1, Vero, СаСо-2 и др. (Рамишвили Л. Г. и др., 1991; Хапчаев Ю. X. и др., 1989; Clark N. et al., 1988; Konno T. et al., 1993; Ward R. et al., 1990; Bernstein D. et al., 1989; Sato K. et al., 1995; Weber B. et al., 1992; Markovska-Daniel J. et al., 1996; Shinozaki K. et al., 1996; Superti F. et al., 1997).

Выделение вируса на клеточных культурах проводят в 2 этапа: заражение вирусом клеточных культур (I) и документирование его репродукции по появлению ЦПД или с помощью ИФА, ИФМ, ПААГ, ПЦР, ПЭМ и метода плякообразования (II). В связи с особой важностью этого метода мы позволим себе некоторую детализацию. Пробы кала забирают в первые 2—3 дня заболевания в стерильную лабораторную посуду и транспортируют в контейнерах со льдом или другим хладагентом. Исследуемый материал необходимо обработать сразу после доставки в лабораторию или хранить при минусовой температуре. Перед началом вирусологических исследований пробы размораживают, забирают 0,5-1 г фекалий и добавляют питательную среду (Игл, Эрл, Хенке) в количестве, необходимом для получения 10% взвеси. Взвесь гомогенезируют до однородного состояния многократным энергичным встряхиванием (с бусами или без них) или замораживанием и оттаиванием. Гомогенизация взвеси встряхиванием является более щадящей, т. к. замораживание и оттаивание вирусосодержащего материала приводит к деструкции VP7 (Nirdnoy W. et al., 1995). Далее суспензию центрифугируют 10-15 минут при 1000-2000 g, освобождают от осадка и надосадочную жидкость разливают но 1 мл для проведения вирусологических исследований или хранят при -20-70 С в зависимости от срока хранения. После этого вирус активируют в течение 30 минут при 37°С трипсином в концентрации 10 мкг/мл и центрифугируют в течение 2 минут при 15000 g. Затем четырехсуточный монослой дважды отмывают ДМЕМ и заражают 1-2 lg (10-30 вирусных частиц на клетку) активированным RV на питательной среде (ДМЕМ, Игл МЕМ, Хенкса), содержащей 10%-ю телячью эмбриональную сыворотку и антибиотики. По данным разных авторов, использовали 100-500 ед. пенициллина, 100-500 мг стрептомицина, 40 мг гентамицина и 50 ед. нистатина в 1 мл. После 2-часовой адсорбции при 37°С клетки отмывали и наносили ДМЕМ, содержащую антибиотики и 4-13 мкг/мл трипсина (Clark Н. et al., 1988; Sato К. et al., 1995).

Положительное влияние трипсина на процессы репликации ротавирусов показали и Konno Т. et al. (1993). Авторы подтвердили, что трипсин активирует продукцию вируса, избирательно влияя на функцию VP4 и наружного капсидного белка, дезинтегрируя их. Это приводит, с одной стороны, к снижению гемаг-глютинирующей активности вируса, а с другой — к усилению проникновения вируса в клетку, т. к. обработанные трипсином вирионы проникают в клетку и реплицируются в ней, а необработанные — подвергаются эндоцитозу и не реплицируются. Таким образом, применение трипсина в дозе от 0,1 до 10 мкг/мл приводит к повышению инфекционности вируса. Зараженную культуру клеток наблюдают в течение 5-7 дней. Появление ЦПД свидетельствует о наличии вируса, который затем документируют ПЭМ, ЭФ в ПААГ или с применением антисывороток — ИЭМ, ИФМ и др.

При отсутствии ЦПД культуру замораживают и делают дополнительные пассажи в тех же условиях за исключением того, что вирус активируют обработкой трипсином 4 мкг/мл при комнатной температуре в течение 2 часов.

Начиная с 4 пассажа, ЦПД обычно обнаруживают через 4-5 дней после заражения (Ward R. et al., 1990; Bernstein D. et al., 1989).

Однако вследствие низкой чувствительности клеточных культур к естественным изолятам, рутинным диагностическим методом вирусовыделение при ротавирусных гастроэнтеритах не стало. Ввиду того, что неадаптированный к клеткам изолят может репродуцироваться в них без ЦПД, обнаружение вируса дополнительными методическими приемами существенно повышает эффективность данного метода. Подтверждением этому служит исследование, проведенное Weber В. et al. (1992). Авторы наряду с обнаружением ротавируса по ЦПД провели сравнительное изучение нескольких методов детекции ротавирусов в зараженных клетках, исследовав 121 пробу кала от детей с гастроэнтеритом в возрасте до 3 лет. Стандартное выделение в клетках МА-104 под контролем ЦПД выявило только 3,3% положительных находок, тогда как применение иммунопероксидазной метки повысило уровень диагностики до 40,5%, а использование ИФА и ЭФ в ПААГ — до 54,4% и 46,3% соответственно.

Поскольку HRV не всегда вызывает ЦПД и реплицируется в обычных клеточных культурах, Genthe В. et al. (199Ц после 18 часов культивирования в МА-104 выявляли вирусный внутриклеточный антиген ИФА при использовании антисывороток, меченных пероксидазой. Сравнение цитоиммунной техники меченых антител с коммерческими тест-системами для постановки, ELISA и латекс-агглютинации показало, что цитоиммунный метод в 10 раз чувствительнее.

Аналогичные результаты получены в работах последних лет. Так по данным Markowska-Daniel J. и др., методом ИФА ротавирус в фекалиях был обнаружен в 32% случаев. Применение культуры клеток МА-104 и документирование репродукции вируса ИФМ, ПЭМ и ЭФ в ПААГ повысило процент обнаружения вируса до 64,0% (Markowska-Daniel J. et al., 1996).

Классическим субстратом для репродукции ротавирусов является клеточная линия почек обезьян МА-104, которая используется наиболее часто, причем не только в диагностических, но и исследовательских целях (Johansen К. et al., 1997; Kobayashi N. et al., 1995), а также в ветеринарной практике (Gulati В. et al., 1997). Показано, что МА-104 поддерживает репродукцию ротавирусов не только группы А, но и С при условии содержания в культуральной среде трипсина в высокой концентрации (Tsunemitsu Н. et al., 1991). Однако, ввиду недостаточной чувствительности клеток к ротавирусам, проводится как поиск других линий, клеток и методов, пригодных для выделения и репродукции ротавирусов, так и разработка способов повышения чувствительности клеток к ротавирусам. Оказалось, что линия клеток карциномы прямой кишки человека НТ-29 была более чувствительной, чем МА-104 при выделении ротавирусов человека. В отличие от МА-104 на НТ-29 обнаруживается рост ротавирусов в первый или последующий пассажи, даже если процент инфицирования клеток оставался низким (Superti F et al., 1991, 1997).

Другая линия клеток карциномы толстого кишечника СаСо-2 также используется для выделения RV. С помощью этой линии клеток в присутствии трипсина (4 мкг/мл) был изолирован RV группы С в Японии, который репродуцировался без ЦПД и был документирован ПЭМ, ИЭМ, ИФМ и обратной РПГА (Shinozaki К. et al., 1996).

Клетки линии почки крупного рогатого скота, GBK также дали более высокие результаты при титровании ротавирусов, выделенных от телят (на 1-2 lg выше, чем в клетках МА-104). Следует заметить, однако, что клетки обрабатывали предварительно диэтиламиноэтилдекстраном в дозе 50 мкг/мл и в поддерживающую среду вносили трипсин в концентарции 5 мкг/мл (Konno Т. et al., 1993).

Повышение чувствительности клеток к вирусам вообще и ротавирусам в частности достигается использованием для этой цели химических и физических методов. Показано, что центрифугирование, постоянное покачивание или резкое температурное воздействие (тепловой шок) способствуют росту числа пораженных клеток, увеличению урожая вируса или повышению уровня вирусовыделения в диагностических вирусологических исследованиях. Из химических способов воздействия следует отметить эффективность диметилсульфоксида, который усиливает процесс трансформации зараженных вирусом клеток, увеличивает число пляк и их размер, повышает урожай вируса (Hyghes J. Н., 1993). Более тонкая идентификация вируса может быть достигнута при помощи бляшек, образующихся под его воздействием в культуре ткани. Метод получения бляшек разработанный Dulbecco R. (1952) в различных модификациях широко применяется и в настоящее время. Принцип метода состоит в том, что разведение вирусной суспензии наносят на однослойные тканевые культуры в чашках Петри, плоскостенных флаконах, в лунках пластмассовых пластин. После адсорбции вируса на клетках их покрывают слоем питательного агара. Благодаря агаровому покрытию, размножение и распространение вируса ограничивается только первоначально инфицированными и соседними с ними клетками. Таким образом образуются органические очаги клеточной дегенерации — так называемые «бляшки» (пляки). Обычно они выявляются окрашиванием слоя клеток прижизненным красителем — нейтральным красным, который либо включают в состав агарового покрытия, либо наносят на него непосредственно перед учетом результатов. Бляшки не адсорбируют краситель и поэтому принимают вид светлых пятен на фоне окрашенных живых клеток (Tosser J. et al., 1994).

Для выявления бляшек кроме нейтрального красного могут быть применены и другие красители, как, например, кристаллический фиолетовый. Одна инфекционная частица вируса образовывает отдельную бляшку, что позволяет применять бляш-кообразование в качестве точного метода для количественного исследования инфекционности вируса и измерения нейтрализационной активности антител. Используя бляшки, вирус можно очистить, т. е. получить его чистые линии (Isa Р., Snodgrass D. 1994; Ward R. et al., 1998). При проведении такой очистки слой клеток после адсорбции на нем вирусов нужно тщательно отмыть от адсорбированных вирусных частиц и лишь после этого нанести агаровое покрытие. Следует отметить, что применение диметилсульфоксида, диэтиламиноэтилденетрана (ДЭАЭ), трипсина оказывает стимулирующее действие на образование бляшек (как и снижение концентрации агара в покрытии).

Шгапо N. et al. (1987) использовали метод получения бляшек для обнаружения ротавируса КРС у новорожденных телят, сравнивая две линии клеточных культур МА-104 и GBK (почечных клеток КРС). Подтвердив возможность использования клеток МА-104, они предложили использовать для этой же цели линию клеток GBK и разработали свою модификацию метода бляшкообразования. В пластиковые чашки Петри диаметром 6 см сеяли 0,8-1,0 х 106 клеток в 5 мл ростовой среды. Через 2-3 дня после образования монослоя клетки промывали и вносили 0 2 мл ротавируса (штамм Линкольн), разведенного культуральной средой с 50 мкг/мл ДЭАЭ. После 90 минут инкубации при 37°С наслаивали 5 мл культуральной среды с 0,8% агара, 10% триптозно-фосфатного бульона, 5 мкг/мл трипсина и 50 мкг/мл ДЭАЭ. Спустя 3 дня, наслаивали второе покрытие, содержащее нейтральный красный в конечном разведении 1:5000. Через 6-8 часов подсчитывали чисйо бляшек.

Другую модификацию получения бляшек использовал Bernstein D. et al. (1989) при изучении выделения вакцинного штамма у взрослых волонтеров, привитых ротавирусной вакциной WC 3. Для этой цели 1 мл предварительно обработанной, как было описано выше, пробы стула инкубировали 30 минут при температуре 37 С с 10 мкг трипсина и наслаивали на монослой МА-104, дважды отмытый сбалансированным раствором Эрла. После 1 часа адсорбции при 37С монослой еще раз отмывали и заливали средой ДМЕМ с антибиотиками, 4 мкг/мл трипсина, 25 мкг/мл ДЭАЭ и 0,2% агарозы и инкубировали 4 дня при 37 С. После удаления среды наслаивали второе агаровое покрытие с кристалл-виолетом для визуализации пляк.

В настоящее время визуализация пляк достигается при помощи иммунофлуоресцентного метода или радиоактивной метки, что увеличивает как специфичность метода, так и его чувствительность (Isa Р. et al., 1994).

Таким образом, вирусовыделение остается важным методом подтверждения этиологии заболевания, но в настоящее время ввиду возможности использования широкого набора современных диагностических методик применение его в качестве рутинного диагностического теста, по-видимому, нецелесообразно.

Электронная микроскопия RV. Обнаружение вируса методом электронного микроскопирования проводится в двух модификациях: прямая электронная микроскопия (ПЭМ) и иммунноэлектронная микроскопия (ИЭМ).

Известно, что в первые дни заболевания содержание ротавируса в копроматериалах достигает таких количеств, при которых возможно его обнаружение под электронным микроскопом в Ю—20% суспензии без дополнительной концентрации. После осветляющего центрифугирования суспензии несколько капель надосадочной жидкости контрастируют растворами фосфорновольфрамовой кислоты (1-2%), ацетата уранила (0,25-1%) или молибдата аммония (1%) и наносят на предметные электронномикроскопические сетки. Исследование препарата проводят в электронном микроскопе при увеличении 50 000. Принадлежность выявленных частиц к ротавирусам определяют по размерам и характерной морфологии.

Метод прямой электронной микроскопии (ПЭМ) в различных модификациях применяется для диагностических и исследовательских целей достаточно широко (Васильев Б. Я. и др., 1989, 1995, 1996; Зарубинский В. Я. и др., 1989; Хаустов В. И.’ и др. 1989; Шелковская Н. Г. и др., 1991; Dennehy Р. et al., 1990; Donneli G. et al., 1993; Zeng C. et al., 1994; Oishi J. et al., 1993; Gonzalez S. et al., 1995; Hendricks M. K. et al., 1995; Jiang B. et al., 1995; Buesa J. et al., 1996; Tinari A. et al., 1996; Andrade G. P. et al., 1997; Superti F. et al., 1998).