Вирусологические исследования. Кишечные заболевания. (Часть 2)

В процессе применения ПЭМ были изучены методические приемы, позволяющие повысить надежность этого метода. Так, сравнивали эффективность выявления морфологии вирусов в ацетате уранила и фосфорновольфрамовой кислоте при pH 4,5, которые показали примерно равные возможности, причем более высокие, чем у молибдата аммония. Повышение pH этих сред приводило к уменьшению количества всех типов распознаваемых под ЭМ частиц.

Применение ПЭМ выявило высокую специфичность метода, однако его чувствительность уступала ряду других лабораторных тестов. Исследование 207 материалов от больных с двумя диагностическими наборами ИФА и ПЭМ в качестве референс-метода показало, что чувствительность ПЭМ составила 80% при 100% специфичности, тогда как чувствительность ИФА на основе моноклональных антител была более высокой (Dennehy Р., 1990). Аналогичные данные были получены ранее Васильевым Б. Я. и др. (1989). Сопоставимые соотношения показателей чувствительности и специфичности ПЭМ и реакции агглютинации латекса (62,5% и 75% соответственно) были показаны также Santos N. и Nozawa С. (1989).

Исследования последних лет подтвердили эти данные. Обследование 103 детей методами ПЭМ, ЭФ в ПААГ и реакцией латекс-агглютинации (РЛА) показало, что ротавирус был документирован у 18% детей. Причем чувствительность методов ПЭМ, ЭФ в ПААГ и РЛА составила соответственно 84%, 90% и 80%, специфичность же 100%, 100% и 81% соответственно (Hendricks М. К. et al., 1995). Помимо диагностических целей, ПЭМ применяется и в научно-исследовательских разработках. Так, Zeng С. et al. (1994) использовали ПЭМ при изучении рота-вирусного белка VP2.

Результаты прямой электронной микроскопии расширили представление о функциях и сборке структурного белка VP2, а также формировании вирусоподобных частиц (ВПЧ) и транспорте метаболитов внутри вириона.

Особенно большие успехи были достигнуты в изучении морфологии ротавирусов при помощи модификации ПЭМ — криоэ-лектронной микроскопии, которая позволяет изучать нативный, неокрашенный вирион с разрешающей способностью 35А, что позволяет выявить поверхностные структуры вируса и каналы, пронизывающие вирион (Yeager М. et al., 1990; 1994, Estes М., 1996; Prasad В. et al., 1996).

Таким образом, прямая электронная микроскопия остается эффективным диагностическим методом и оптимальным рефе-ренс-тестом при освоении новых диагностических методик ввиду неоспоримости получаемых при этом результатов, вследствие чего ряд исследователей считают электронную микроскопию «золотым стандартом» (Bryden А. S., 1990). Уникальность ПЭМ состоит и в ее способности обнаруживать помимо всех групп ротавирусов и другие кишечные патогены: адено-, калици-, астро- и короновирусы, а также неизвестные до настоящего времени инфекционные агенты (Espinoza F. et al., 1997).

Иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ) дает возможность не только идентифицировать вирус в материалах от больного по его морфологическим признакам, но и подтвердить этиологию заболевания на специфическом уровне. Принцип проведения исследования состоит в следующем: иммунную сыворотку к ротавирусу в разведении 1:5 смешивают с 0,4 мл 1% осветленной центрифугированием фекальной суспензии. Смесь выдерживают 1 час при комнатной температуре, 12 часов при 4°С, затем центрифугируют в течение 90 минут при 15 000 об./мин для осаждения вирусных частиц и иммунных комплексов. Надоса-дочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в нескольких каплях дистиллированной воды, окрашивают (как уже было сказано выше) и наносят на предметные сетки. Микроскопию препаратов осуществляют при увеличении 50 000.

В этом случае частицы ротавируса с характерной морфологией и размерами выявляются в виде специфических иммунных комплексов, интенсивность образования которых оценивают по числу скоплений на сетке и выражают по условной шкале от 0 до 4+.

По чувствительности и специфичности ИЭМ может соперничать не только с ПЭМ, но даже с таким распространенным методом, как ИФА. Так, при типировании 24 штаммов ротавирусов с помощью ИФА и ИЭМ на основе моноклональных антител к VP7 оказалось, что ИЭМ в 2-16 раз чувствительнее, чем ИФА (Gerna G. et al., 1988).

Помимо стандартной техники ИЭМ в работах ряда авторов проведено изучение специфичности и чувствительности нескольких модификаций этого метода: фильтрация комплекса в агар, иммуносорбентной ИЭМ и макромаркирования комплексом белок А коллоидное золото. Показано, что все модификации ИЭМ, как минимум, в 20-30 раз чувствительнее прямой методики. Наибольшей чувствительностью отличается вариант с меткой белком А — коллоидное золото, который оказался в 1000 раз чувствительнее, чем прямой метод ИЭМ (Athanassions R. et al., 1994; Gonzalez S. A. et al., 1995). Очевидно, что дальнейшее усовершенствование ИЭМ откроет новые возможности для этого метода, но его высокая чувствительность может быть реализована при тщательной стандартизации реагентов, обеспечения кон-тролями, а также при высокой квалификации исследователя.

Область применения ИЭМ весьма обширна: научно-исследовательские разработки, клиническая практика, лабораторная диагностика, включая типирование штаммов ротавирусов, расшифровка эпидемических вспышек и др. (Gerna G. et al., 1988; Васильев Б. Я. и др., 1989; Bates Р. R. et al., 1993; Oishi J. et al., 1993; Zeng C. et al., 1994; Tokieda M. et al., 1996).

ИЭМ (как и ПЭМ) применяют также в качестве референс-теста для оценки показателей чувствительности и специфичности коммерческих диагностических наборов (Ruggeri F. et al., 1992). Иллюстрацией ценности использования метода ИЭМ в расшифровке эпидемиологических вспышек могут служить данные Oishi J. (1993). Так, при вспышке гастроэнтеритов у студентов одного из колледжей в Японии методом ПЭМ по морфологическим признакам в фекалиях больных были обнаружены ротавирусы. Причем эти материалы оказались негативны в ИФА относительно ротавирусов группы А. Применение ИЭМ показало, что эти ротавирусы относятся к возбудителям группы С, что в дальнейшем было подтверждено данными ПЦР.

Суммируя результаты применения ПЭМ и ИЭМ, следует отметить, что эти методы имели первостепенное значение на начальных этапах диагностики ротавирусной инфекции. Однако в дальнейшем, с разработкой приемов обнаружения ротавирусно-го антигена, превосходящих ПЭМ и ИЭМ по чувствительности, простоте и скорости проведения, возможности массового обследования больших контингентов при низких материальных затратах, ПЭМ и ИЭМ отводится почетная роль референс-методов.

В то же время ПЭМ и ИЭМ и до настоящего времени используются в научно-исследовательской и клинической практике как методы обнаружения новых, -неизвестных инфекционных агентов.

Иммунофлюоресцентный метод (ИФМ) применяется в диагностических исследованиях для выявления антигена в клеточной культуре, зараженной материалом от больного, в биоптатах и секционном материале, а также в копроматериалах в двух модификациях.

Принцип прямого метода ИФМ сводится к обработке объекта (зараженных клеток или срезов тканей) специфическими антителами, меченными флюоресцирующим красителем, которые, контактируя с антигеном, дают в люминесцентном микроскопе под влиянием коротковолновой части спектра видимое длинноволновое свечение (зеленое или красное в зависимости от вида красителя). При непрямом методе ИФ объект подвергают двухступенчатой обработке сначала иммунной сывороткой к искомому антигену, а затем меченными флюорохромом иммуноглобулинами, выделенными из антивидовой сыворотки.

Методика проведения ИФМ чрезвычайно проста: мазки-отпечатки, зараженные клетки, осветленная суспензия фекалий фиксируются на предметных стеклах ацетоном при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем препарат обрабатывают антиротавирусной флюоресцирующей сывороткой при одновременном контрастировании фона конъюгатом альбумин-родамином. После инкубирования при 37 С в течение 30 минут, избыток конъюгата отмывают фосфатным буфером (pH 7,0), промывают, высушивают и просматривают в люминесцентном микроскопе. Следует отметить, что взятие копроматериалов в первые часы от начала заболевания увеличивает возможность обнаружения ротавирусного антигена. При проведении ИФМ необходимо включение контролей, в качестве которых применяются: обработка специфическим конъюгатом неинфицирован-ных клеток, а также — гетерологичным конъюгатом клеток, инфицированных ротавирусом. Наиболее часто ИФМ используется при исследовании культуры ткани, зараженной материалами от больных людей или животных, что позволяет быстро обнаружить вируссодержащие.клетки, не ожидая ЦПД (Мнико-ва Л. А., 1988; Harsi C.et al., 1991; Tokieda M. et al., 1996). Так при обследовании в ИФМ и ЭФ в ПААГ 268 больных гастроэнтеритами детей до 1 года было выявлено 40 положительных проб (14,9%), в иммунноферментном тесте — 46 (17,1%). Совпадение результатов этих методов наблюдалось в 72% случаях (Harsi С et al., 1991).

В последние годы иммунофлюоресцентная метка антител широко используется для выявления фокусов (пляк) ротавирусов в культуре клеток, что существенно повышает чувствительность этого метода (Isa P.et al., 1994; Barnes G. et al., 1997). Применяется ИФМ и с целью обнаружения ротавирусов во внешней среде (Strappe Р., 1990).

Таким образом, в настоящее время иммунофлюоресцентный метод исследования в классическом варианте находит ограниченное применение в диагностике ротавирусных гастроэнтеритов.

Преципитационные тесты основаны на взаимодействии специфической сыворотки с вирусными антигенами в агаре под влиянием осмотических процессов (РПГ) или при воздействии постоянного электрического поля — встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ) (Галко Н. В. и др., 1986; Залесских А. Ф. и др., 1990). Указанные методы были использованы на начальных этапах изучения ротавирусной инфекции и в настоящее время практически не применяются в связи с разработкой более совершенных тестов, за исключением тонких научных исследований (Devitt С. et al., 1993). Правда, в последние годы преципитационные тесты были усовершенствованы путем введения в реакцию ротавирусных частиц, меченных 32Р, что позволило увеличить как чувствительность, так и специфичность метода (Tosser J. et al., 1994; Johansen К. et al., 1994; Richardson S. et al., 1993; Colomina J. et al., 1998), а также белка А золотистого стафилококка (Colomina J. et al., 1998).

Иммуноферментный анализ (ИФА) в диагностике ротавирусных гастроэнтеритов применяется наиболее широко. Число публикаций на эту тему насчитывает несколько сотен.

Принцип метода твердофазных ИФА сводится к тому, что некий носитель из полимерного материала (лунки микропанелей, бусинки, палочки и т. д.) сенсибилизируют антителами к ротавирусам, добавляют исследуемый материал от больного и инкубируют при 36°С. Образовавшийся комплекс АТ-АГ выявляют либо антителами, меченными ферментам, либо сначала обрабатывают сывороткой к искомому антигену, а затем антиви-довыми иммуноглобулинами, меченными ферментом. Выявление комплекса АТ-АГ-АТ + фермент или АТ-АГ-АТ1-АТ2 + фермент осуществляют добавлением субстрата для появления окрашенного продукта реакции. Учет результатов реакции проводят с помощью иммуноферментных анализаторов. Помимо выявления ротавирусного антигена ИФА позволяет также проводить серотипирование изолятов непосредственно в материалах от больных. Для этой цели был предложен метод блокирования определенных эпитопов генома RV с помощью моноклональных антител типовой или подгрупповой специфичности (Green К. et al., 1990). Применение моноклональных антител VP7 и VP4 различных серотипов ротавирусов человека позволяет провести не только типирование изолятов, но и способствует изучению эпидемических процессов (Bishop R. et al., 1989; Gerna G. et al 1989; UnicombL. et al., 1993; Buesa G. et al., 1996; Gomez J. et al., 1990; Begue R. et al., 1992; Coulson B. S., 1993; Woods P. et al., 1992; Nirdnoy W. et al., 1995; Wu H. et al., 1998; Masen-dyzac P. et al., 1998).

Первые наборы ИФА были созданы как лабораторные тесты в конце 70-х годов, потом были разработаны коммерческие препараты. Первым коммерческим набором является Rotazyme (Abbot Laboratories Ltd), в котором использовали шариковую систему. Затем Dako Ltd создало более совершенный набор — Fast Elisa Dako Ltd, и в настоящее время число коммерческих тестов, используемых в диагностической практике, чрезвычайно велико: IDEIA Rotavirus test, Dakopatts, тест-система WHO, Testpack Rotavirus, Rotavirus EIA, Pathfinder, Kallestadt| Rotaclone, Rotavirus BIO — Bioenzabead Litton, Rotazyme II Abbott, Rotoscreen, Wellcozyme, Enzymgnost Rotavirus, Rotavirus Immunoassay, VIDAS Rotavirus, NIV (Gowez J. et al., 1990; Begue R. et al., 1992; Rosmus K. et al., 1992; Kelkar S., 1993; Unicomb L. et al., 1993; Sanchez R. et al., 1993; Broor S. et al.’ 1993; Dennehy P. et al., 1994).